Johnny Test jest zwykłym jedenastolatkiem mieszkającym z rodzicami, dwiema siostrami i psem. Jego 13-letnie siostry, Susan i Mary, to naukowe geniusze, które często wykorzystują brata jako królika doświadczalnego. Jego największym przyjacielem jest gadający pies Dukey, z którym często przeżywa niesamowite przygody.